Leonardo creó La Última Cena, su mejor obra, la más serena y alejada del mundo temporal, durante esos años característicos por los conflictos bélicos, las intrigas, las preocupaciones y las calamidades. Se cree que en 1494 el duque de Milán Ludovico Sforza, llamado "el Moro" encargó a Leonardo la realización de un fresco para el refectorio de la iglesia dominica de Santa Maria delle Grazie, Milán. Ello explicaría las insignias ducales que hay pintadas en las tres lunetas superiores. Leonardo trabajó en esta obra más deprisa y con mayor continuidad que nunca durante unos tres años. De alguna manera, su naturaleza, que tendía hacia el colosalismo, supo hallar en este cuadro una tarea que lo absorbió por completo, forzando al artista a finalizarla.En su novella LVIII, Matteo Bandello, que conoció bien a Leonardo, escribe que lo observó muchas veces«a la mañana temprano subir al andamio, porque la Última Cena estaba un poco en alto; desde que salía el Sol hasta la última hora de la tarde estaba allí, sin quitarse nunca el pincel de la mano, olvidándose de comer y de beber, pintando continuamente. Después sabía estarse dos, tres o cuatro días, que no pintaba, y aún así se quedaba allí una o dos horas cada día y solamente contemplaba, consideraba y examinando para sí, las figuras que había pintado. También lo vi, lo que parecía caso de simpleza o excentricidad, cuando el Sol está en lo alto, salir de su taller en la corte vieja» - sobre el lugar del actual Palazzo Reale - «donde estaba aquel asombroso Caballo compuesto de tierra, y venirse derecho al convento de las Gracias: y subiéndose al andamio tomar el pincel, y dar una o dos pinceladas a una de aquellas figuras, y marcharse sin entretenerse».
Esta forma de pintar, tan distinta de la rapidez y seguridad que exige la tradicional pintura al fresco, explican que el pintor optara por una técnica distinta y también que se demorase durante años su acabado.
Giorgio Vasari en sus Vite también describe en detalle cómo lo trabajó, cómo algunos días pintaría como una furia, y otros pasaría horas sólo mirándolo, y cómo paseaba por las calles de la ciudad buscando una cara para Judas, el traidor; al respecto cuenta la anécdota de que esta forma de trabajar impacientaba al prior del convento y éste fue a quejarse al duque, quien llamó al pintor para pedirle que acelerara el trabajo:«Leonardo explicó que los hombres de su genio a veces producen más cuando trabajan menos, por tener la mente ocupada en precisar ideas que acababan por resolverse en forma y expresión. Además, informó al duque que carecía todavía de modelos para las figuras del Salvador y de Judas; (...) temía que no fuera posible encontrar nadie que, habiendo recibido tantos beneficios de su Señor, como Judas, poseyera un corazón tan depravado hasta hacerle traición. Añadió que si, continuando su esfuerzo, no podía encontrarlo, tendría que poner como la cara de Judas el retrato del impertinente y quisquilloso prior».
Igualmente, el escritor Giambattista Giraldi, se hizo eco de esta forma de trabajar basándose en los recuerdos de su padre:«Antes de pintar una figura, estudiaba primero su naturaleza y su aspecto [...] Cuando se había formado una idea clara, se dirigía a los lugares en los que sabía que hallaría personas del tipo que buscaba, y observaba con atención sus rostros, su comportamientos, sus costumbres y sus movimientos. A penas veía algo que podía servirle para sus fines, lo dibujaba a lápiz en el cuadernillo de apuntes que siempre llevaba a la cintura. Este proceder lo repetía tantas veces como juzgase necesario para dar forma a la obra que tenía en mente. A continuación plasmaba todo esto en una figura que, una vez creada, movía el asombro».Así pues, Leonardo observaba cuidadosamente los modelos del natural, pero no es algo habitual en aquella época. En general se copiaban los tipos conocidos y ya probados; algunos artistas repetían una y otra vez a lo largo de su vida un tipo que les había salido bien y había tenido éxito, como, por ejemplo, Perugino, el condiscípulo de Leonardo. Éste, empero, jamás se repitió a sí mismo; siempre consideró cada una de sus obras una tarea completamente nueva, peculiar y diferente de la anterior. Leonardo procuró dotar a sus figuras de la mayor diversidad posible y del máximo movimiento y contraste. En su libro de pintura aconseja «Los movimientos de las personas son tan diferentes como los estados de ánimo que se suscitan en sus almas, y cada uno de ellos mueve en distintos grados a las personas. En otro pasaje se refiere al efecto de los contrastes «[...] Lo feo junto a lo bello, lo grande junto a lo pequeño, el anciano junto al joven, lo fuerte junto a lo débil: hay que alternar y confrontar esos extremos tanto como sea posible.» Esta proximidad y antagonismo de las figuras es lo que da su riqueza a La Última Cena: Judas, el malvado/Juan, el bello y bueno; cabezas ancianas/cabezas jóvenes; personas excitadas/personas tranquilas. Aún el mundo puede apreciar el carácter innovador del cuadro a causa de las innumerables imitaciones y reproducciones posteriores, la obra nos produce un efecto de serenidad y sencillez, de concentración alrededor del núcleo de la escena que en ella se desarrolla.
En 1497 el duque de Milán solicitó al artista que concluyera la Última Cena, que terminó, probablemente, a finales de año. Según Andrés García Corneille en su libro Da Vinci comenta que «cuando Leonardo comenzó su obra, él sabía que iba a demandarle mucho tiempo y que difícilmente vería mucho dinero por ella (Ya que se trataba del pedido de un duque), cosa que contravenía abiertamente a los reglamentos del gremio de artistas al que pertenecía, y sin cuya anuencia era imposible ejecutar una obra en Florencia. De hecho, jamás pidió un sólo centavo por la obra que hizo, cosa que al duque le sorprendió y no dijo ninguna palabra». Cuando acabó, la pintura fue alabada como una obra maestra de diseño y caracterización. La dio por terminada, aunque él, eterno insatisfecho declaró que tendría que seguir trabajando en ella. Fue expuesta a la vista de todos y contemplada por muchos. La fama que el «gran caballo» había hecho surgir se asentó sobre cimientos más sólidos. Desde ese momento se le consideró sin discusión uno de los primeros maestros de Italia, si no el primero. Los artistas acudían desde muy lejos al refectorio del convento de Santa María delle Grazie, miraban la pintura con detenimiento, la copiaban y la discutían. El rey de Francia, al entrar en Milán, acarició la idea de desprender el fresco de la pared para llevárselo a su país.
Pronto se puso en evidencia, sin embargo, que nada más acabarse ya empezaba a desprenderse de la pared. Desgraciadamente, el empleo experimental del óleo sobre yeso seco provocó problemas técnicos que condujeron a su rápido deterioro hacia el año 1500 lo cual provocó numerosas restauraciones en la magnífica obra. Leonardo, en lugar de usar la fiable técnica del fresco, que exigía una rapidez de ejecución impropia de él, había experimentado con diferentes agentes aglutinadores de la pintura, que fueron afectados por moho y se escamaron.
Desde 1726 se llevaron a cabo intentos fallidos de restauración y conservación. Goethe, que vio la estancia con escasas transformaciones, la describe así:«Frente a la entrada, en la zona más estrecha y al fondo de la sala, estaba la mesa del prior, y a ambos lados las de los restantes monjes, colocadas sobre una especie de grada a cierta altura del suelo. De repente, cuando al entrar uno se daba la vuelta, veía pintada en la cuarta pared y encima de las puertas la cuarta mesa, con Jesús y los Apóstoles sentados a ella como si fueran un grupo más de la reunión. La hora de comer, cuando las mesas del prior y de Cristo se encontraban frente a frente, encerrando en medio a los demás monjes, tuvo que ser, por fuerza, una escena digna de verse».En 1977 se inició un programa haciendo uso de las más moderna tecnologías, como consecuencia del cual se han experimentado algunas mejoras. Aunque la mayor parte de la superficie original se ha perdido, la grandiosidad de la composición y la penetración fisonómica y psicológica de los personajes dan una vaga visión de su pasado esplendor.La pintura se ha mantenido como una de las obras de arte más reproducidas, con innumerables copias realizadas en todo tipo de medios, desde alfombras hasta camafeo.
